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酶免疫斑点试验

酶免疫斑点试验(enzym e im m unoblotassay)

  【原理】

  将滤纸或纤维素膜作为固相载体交联或吸附抗原后、再分别与未知抗体和酶标第二抗体反应,经酶催化底物而显色,从而检测相应抗体。

  【试剂】

  (1)硝酸纤维膜,孔径为 0.3μm。

  (2)2% BSA(蒸馏水配制)。

  (3)0.01mol/L pH 7.2 PBS。

  (4)抗人 Ig-HRP 结合物。

  (5)二氨基联苯胺(DAB)底物溶液:

  将 30mgDAB 溶于 0.05mol/L pH 7.4 Tris-HCl缓冲液 100mL 中,过滤,4℃ 暗处贮存,临用时加 3% H2O2,较终浓度为 0.05% 。

  【方法】

  1)微孔滤膜切成 4mm ×50mm 的长条,用铅笔标明位置,点距 4mm,浸于 PBS中 15min,用滤纸吸干。

  2)在滤膜相应位置点精子抗原 2μL,4℃ 作用 30min,吸干,PBS漂洗 3次。

  3)浸于 2% BSA 溶液中,4℃ 封闭 15min,洗 3次,吸干。

  4)1∶4待检血清点样 0.5μL,4℃ 15min,洗 3次,吸干。

  5)浸于酶标二抗溶液(1∶1 500)中,4℃ 15min,洗 4次,每次 5min。

  6)DAB-H2O2底物显色 10min,PBS洗 0.5min。

  【结果】

  呈现褐色斑点者为阳性,无色或微黄色为阴性。


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